Son père, Takano Sadayoshi est un samouraï de rang inférieur du han de Nagaoka. « Isoroku » est un ancien terme japonais qui signifie « 56 », soit l’âge de son père au moment de la naissance d’Isoroku. En 1916, Isoroku est adopté par la famille Yamamoto et prit son nom. Il était courant que des familles sans fils adoptent de jeunes garçons pour faire perdurer le nom. En 1918, Isoroku épouse Reiko Misashi avec laquelle il a quatre enfants : deux fils et deux filles.

Yamamoto s’engage en 1901 dans l’académie navale à Etajima (Hiroshima) et est diplômé en 1904. En 1905, pendant la guerre russo-japonaise, il participe à la bataille de Tsoushima en tant qu’enseigne de vaisseau à bord du croiseur Nisshin. Le 27 mai 1905, à la suite de l’explosion d’une batterie, Yamamoto perd deux doigts et reçoit 120 éclats métalliques. Après la guerre, il sert pendant plusieurs années à bord d’autres navires. Entre 1907 et 1908, il suivit des cours à l’École des torpilles.

Il se rend ensuite aux États-Unis, à l’université Harvard entre 1919 et 1921. Il travaille comme fermier à Dartmouth dans le Massachusetts.

Entre 1925 et 1928, Yamamoto est attaché naval pour l’ambassade japonaise à Washington. Il obtint le commandement du porte-avions japonais Akagi en 1928, suivi du commandement du Bureau technique du Département de l’Aéronautique navale de 1930 à1933 et finalement, le grade de vice-amiral à bord de l’Akagi en 1933. Après un travail diplomatique durant la conférence de Londres sur le désarmement naval, il obtient le poste stratégique de chef du Service central de l’Aéronautique navale. Il devient vice-ministre de la marine en 1936, un mandat qu’il assure jusqu’à sa nomination en tant que commandant en chef de la flotte combinée. En parallèle, il s’occupe du commandement du Département de l’Aéronautique navale.

Malgré ses affinités avec les États-Unis de par ses études, son travail lié à la diplomatie et l’ambassade à Washington, Yamamoto fut inévitablement impliqué, que ce soit directement ou indirectement, dans la préparation de la guerre contre les États-Unis. Ses actions n’allèrent toutefois pas dans l’axe voulu par les militaires les plus ambitieux. Sa participation à la seconde conférence de Londres sur le désarmement naval en 1930 fut un échec pour les militaires. Le Japon n’obtint pas la parité avec la flotte américaine. Yamamoto s’opposa systématiquement à l’invasion de la Mandchourie en 1931 et à la guerre contre la Chine qui en découla en 1937. Il désapprouva également les accords et l’alliance avec l’Allemagne nazie.

Le 15 novembre 1940, il est promu amiral. Yamamoto lance un avertissement à Fumimaro Konoe, alors premier ministre, en lui indiquant clairement qu’il redoute l’issue et les conséquences du conflit pour le Japon après six mois. Les faits lui donnèrent en partie raison.

Pour remotiver ses troupes après la débâcle de Guadalcanal, Yamamoto décida de visiter plusieurs bases dans le sud du Pacifique. Le 14 avril 1943, dans le cadre du programme Magic, les services de renseignements américains interceptèrent et déchiffrèrent un message contenant des informations détaillées sur l’itinéraire qu’emprunterait Yamamoto, les horaires et le dispositif prévu pour le transporter et l’escorter. Il était prévu de faire voler l’amiral de Rabaul jusqu’à l’aérodrome de Ballale sur une île près de Bougainville dans les îles Salomon. Le voyage devait avoir lieu le matin du 18 avril.

Le matin du 18 avril, malgré les avertissements de ses conseillers qui craignaient une embuscade, Yamamoto décolla comme prévu de Rabaul avec une escorte de 6 Zéros pour un voyage d’environ 500 kilomètres. Peu après, sur les 18 P-38 spécialement préparés pour cette mission avec des réservoirs largables supplémentaires, 16 prirent leur envol de Guadalcanal  et volèrent environ 700 kilomètres en maintenant un silence radio complet. À 9 h 34 (heure de Tokyo), les deux groupes d’appareils se rencontrèrent et le combat débuta entre les 16 P-38 et les 6 zéros japonais.

Le site du crash et le corps de l’amiral furent découverts le lendemain par un groupe de secours japonais dans la jungle au nord de Buin. Le lieutenant Hamasuna commandait l’opération et fit un compte-rendu de la scène : Yamamoto avait été éjecté de l’épave, sa main couverte d’un gant blanc tenait son sabre de samouraï, droit dans son siège sous un arbre. Hamasuna ajouta qu’il reconnut immédiatement Yamamoto, la tête penchée vers le bas. Une autopsie fut effectuée et montra que Yamamoto avait reçu deux balles : une dans l’épaule, l’autre ayant traversé sa joue et étant ressortie au-dessus de son œil droit.

Le capitaine Watanabe et le reste de l’équipe de Yamamoto incinérèrent les restes de l’amiral à Buin. Ses cendres furent envoyées à Tokyo à bord du Musashi. Les funérailles nationales eurent lieu le 3 juin 1943 et le titre d’Amiral de la Flotte lui fut attribué à titre posthume, en même temps que l’Ordre du Chrysanthème.

Yamamoto est le seul combattant non allemand qui soit honoré de la Croix de chevalier avec feuilles de chêne et épées.

Une partie de ses cendres fut enterrée dans le cimetière public de Tama à Tokyo, le reste se trouve auprès de ses ancêtres au temple Chuko-Hi à Nagaoka.